CNSH53
Chào mừng bạn trở lại !!!

CNSH53

(*_*)
 
IndexIndex  CalendarCalendar  Trợ giúpTrợ giúp  Tìm kiếmTìm kiếm  Thành viênThành viên  NhómNhóm  Đăng kýĐăng ký  Đăng Nhập  
HAPPY NEW YEAR 2012 !
CÔNG NGHỆ SINH HỌC K53
CHÚC MỪNG NĂM MỚI !

Share | 
 

 Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA

Xem chủ đề cũ hơn Xem chủ đề mới hơn Go down 
Tác giảThông điệp
dreamworld
MOD
MOD


Tổng số bài gửi : 21
Points : 2501
Reputation : 0
Join date : 13/03/2010
Age : 27
Đến từ : Nơi xa lắm

Bài gửiTiêu đề: Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA   Tue Nov 29, 2011 5:45 pm

It is not possible to clone mRNA directly, so it has to be converted into DNA before being inserted into a suitable vector. This is achieved using the enzyme reverse transcriptase (RTase; see Section 4.2.2) to produce complementary DNA (also known as copy DNA or cDNA). The first step in cloning from mRNA is to convert the mRNA into double-stranded complementary DNA (cDNA; also known as copy DNA) using the enzymes reverse transcriptase and DNA polymerase. The classic early method of cDNA synthesis utilises the poly(A) tract at the 3’ end of the mRNA to bind an oligo(dT) primer, which provides the 3’-OH group required by RTase (Fig. 6.2). Given the four dNTPs and suitable conditions, RTase will synthesise a copy of the mRNA to produce a cDNA • mRNA hybrid. The mRNA can be removed by alkaline hydrolysis and the single-stranded (ss) cDNA converted into double-stranded (ds) cDNA by using a DNA polymerase. In this second-strand synthesis the priming 3’-OH is generated by short hairpin loop regions that form at the end of the ss cDNA. After second-strand synthesis, the ds cDNA can be trimmed by S1 nuclease to give a flush-ended molecule, which can then be cloned in a suitable vector.
Several problems are often encountered in synthesising cDNA using the method just outlined. First, synthesis of full-length cDNAs may be inefficient, particularly if the mRNA is relatively long. This is
a serious problem if expression of the cDNA is required, as it may not contain the entire coding sequence of the gene. Such inefficient full-length cDNA synthesis also means that the 3’ regions of the mRNA tend to be over-represented in the cDNA population. Second, problems can arise from the use of S1 nuclease, which may remove some important 5’ sequences when it is used to trim the ds cDNA.
More recent methods for cDNA synthesis overcome the afore-mentioned problems to a great extent, and the original method is now rarely used. One of the simplest adaptations involves the use of oligo(dC) tailing to permit oligo(dG)-primed second-strand cDNA synthesis (Fig. 6.3). The dC tails are added to the 3’ termini of the cDNA using the enzyme terminal transferase. This functions most efficiently on accessible 3’ termini, and the tailing reaction therefore favours full-length cDNAs in which the 3’ terminus is not ‘hidden’ by the mRNA template. The method also obviates the need for S1 nuclease treatment and, thus, full length cDNA production is enhanced further.
As we have already mentioned in a number of contexts, many sup-pliers now produce kits for cDNA synthesis and cloning. Often these have been optimised for a particular application, and the number of steps involved is usually reduced to a minimum. In many ways the mystique that surrounded cDNA synthesis in the early days has now gone, and the techniques available make full-length cDNA synthesis a relatively straightforward business. The key to success is to obtain good-quality mRNA preparations and to take great care in handling these. In particular, contamination with nucleases must be avoided.
Although the poly(A) tract of eukaryotic mRNAs is often used for priming cDNA synthesis, there may be cases where this is not appropriate. Where the mRNA is not polyadenylated, random oligonucleotide primers may be used to initiate cDNA synthesis. Or, if all or part of the amino acid sequence of the desired protein is known, a specific oligonucleotide primer can be synthesised and used to initiate cDNA synthesis. This can be of great benefit in that specific mRNAs may be copied into cDNA, which simplifies the screening procedure when the clones are obtained. An additional possibility with this approach is to use the PCR to amplify the desired sequence selectively.
Having generated the cDNA fragments, the cloning procedure can continue. The choice of vector system - plasmid or phage, or perhaps cosmid or phagemid - will probably have been made before beginning the procedure or will have been determined by the manufacturer of the cloning kit. Examples of cloning strategies based on the use of plasmid and phage vectors are given next.

_________________
Everything i do, i do it for you
Về Đầu Trang Go down
Xem lý lịch thành viên
PhanNgan54B
New member
New member


Tổng số bài gửi : 3
Points : 1861
Reputation : 0
Join date : 09/11/2011

Bài gửiTiêu đề: Re: Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA   Thu Dec 01, 2011 9:16 pm

híc. anh post dài thế này thì dịch nản lắm ạ. Crying or Very sad mà hình như có mỗi mình anh hay vào đây thăm thú thôi, nản nhỉ. Smile
bọn em đang ôn thi nên khộng tham ja dịch được ạ.
chắc là hôm nào sắp thi tiếng anh chuyên ngành em vào đây thử dịch xem. hi Smile
Về Đầu Trang Go down
Xem lý lịch thành viên
dreamworld
MOD
MOD


Tổng số bài gửi : 21
Points : 2501
Reputation : 0
Join date : 13/03/2010
Age : 27
Đến từ : Nơi xa lắm

Bài gửiTiêu đề: Re: Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA   Fri Dec 02, 2011 9:27 pm

PhanNgan54B đã viết:
híc. anh post dài thế này thì dịch nản lắm ạ. Crying or Very sad mà hình như có mỗi mình anh hay vào đây thăm thú thôi, nản nhỉ. Smile
bọn em đang ôn thi nên khộng tham ja dịch được ạ.
chắc là hôm nào sắp thi tiếng anh chuyên ngành em vào đây thử dịch xem. hi Smile
Vì nó là một mục nên a muốn post lên cho bọn e biết thêm kiến thức thôi Smile. Đoạn này cũng dễ nên a mới post lên. Mục đích chính để mọi người nắm đc kiến thức chuyên ngành, + nâng vốn từ vựng + kĩ năng dịch thuật thôi Smile

A đang ấp ủ mấy thứSmile. Hi vọng mấy đứa sẽ giúp đc a Razz

_________________
Everything i do, i do it for you
Về Đầu Trang Go down
Xem lý lịch thành viên
Sponsored content




Bài gửiTiêu đề: Re: Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA   Today at 8:07 am

Về Đầu Trang Go down
 
Chủ đề tiếp theo: synthesis of cDNA
Xem chủ đề cũ hơn Xem chủ đề mới hơn Về Đầu Trang 
Trang 1 trong tổng số 1 trang
 Similar topics
-
» ti vi sam sung cs21a530fl bị co chiều ngang và hẹp theo chiều dọc
» Tìm hiểu về CA trong dòng truyền DVB stream
» Con người đang cố gắng liên lạc với người ngoài hành tinh như thế nào
» Cước thuê bao của TH Cáp Viettel là 20.000/tháng?
» PAN (đặc chủng) của TV các loại và cách khắc phục.

Permissions in this forum:Bạn không có quyền trả lời bài viết
CNSH53  :: Câu lạc bộ :: Tiếng anh-
Chuyển đến